亲和力测定服务引起WB实验背景过高的因素：
　　应该是多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。
　　1、封闭不完全：一抗或二抗只要结合到膜上，就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能再4℃孵育，因为会凝结。如果想在低温封闭的话，可以用3%的BSA 。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景!
　　2、显色过度：显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久，背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰课件，而背景几乎没有货很少时，将膜及时取出。
　　3、转移缓冲液或设备污染：使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也一定要认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外 ，每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。
　　4、抗体稀释度不正确：一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说，以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：1000-1：10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。抗体稀释度不够，会产生非特异性的结合，带来高背景。
　　5、二抗不纯：没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用，产生杂带。