抗独特型抗体服务AchE活性分光光度法试剂盒测定操作
时间:2023-11-19 00:09:52 阅读:42
抗独特型抗体服务测定原理:
AchE即乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase),催化Ach水解生成胆碱,胆碱与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)作用生成5-巯基-硝基苯甲酸(TNB);TNB在412nm处有吸收峰,通过测定412 nm吸光度增加速率,计算AchE活性。
测定操作:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL上清液、800 μL试剂一、50μL试剂二和50 μL试剂三,迅速混匀,于412nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A1,第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。
AchE活性计算公式:
1. 组织AchE活性
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr ×V样)÷T
= 245×△A÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/g鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷(W ×V样÷V样总)÷T
= 245×△A÷W
2. 细菌、细胞AchE活性
活性单位定义:每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 245×△A÷细胞数量
3. 血清AchE活性
活性单位定义:每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T
=245×△A
ε:TNB摩尔消光系数,13.6×103 L/mol/cm;V反总:反应体系总体积(L),1 mL=0.001 L;106:1mol=1×106μmol;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度(mg/mL);W:样本质量,g;V样:加入上清液体积(mL),0.1 mL;T:反应时间(min),3 min。
AchE即乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase),催化Ach水解生成胆碱,胆碱与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)作用生成5-巯基-硝基苯甲酸(TNB);TNB在412nm处有吸收峰,通过测定412 nm吸光度增加速率,计算AchE活性。
测定操作:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL上清液、800 μL试剂一、50μL试剂二和50 μL试剂三,迅速混匀,于412nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A1,第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。
AchE活性计算公式:
1. 组织AchE活性
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr ×V样)÷T
= 245×△A÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/g鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷(W ×V样÷V样总)÷T
= 245×△A÷W
2. 细菌、细胞AchE活性
活性单位定义:每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 245×△A÷细胞数量
3. 血清AchE活性
活性单位定义:每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T
=245×△A
ε:TNB摩尔消光系数,13.6×103 L/mol/cm;V反总:反应体系总体积(L),1 mL=0.001 L;106:1mol=1×106μmol;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度(mg/mL);W:样本质量,g;V样:加入上清液体积(mL),0.1 mL;T:反应时间(min),3 min。
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