基于CRISPR技术敲除FUT8基因的方法与流程
时间:2022-08-29 21:42:03 阅读:121
ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity,抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)是指由NK(natural killer)细胞引发的一系列免疫反应,NK细胞通过FcγRIII受体与抗体分子恒定区(Fc)结合,然后通过穿孔素和颗粒酶在靶细胞表面引起细胞降解和引发细胞凋亡。然而,抗体分子的恒定区和FcγRIII受体之间的相互作用对抗体分子恒定区的糖基化水平非常地敏感,完全没有糖基化的抗体恒定区或者糖基化程度过高的抗体恒定区都无法正常地与FcγRIII受体结合。其中,更加重要的是岩藻糖基化的水平,已有文献报道没有岩藻糖基化的Fc端与FcγRIII受体的亲和力明显要比岩藻糖基化的Fc端高,相应的体外ADCC作用活性要强100倍。
FUT8大多数由哺乳动物细胞产生的单克隆抗体都是岩藻糖基化的,这其中当然也包括了最广泛使用的中国仓鼠卵巢细胞,岩藻糖与抗体Fc端上的氨基葡萄糖通过一个α-1,6糖苷键结合。在哺乳动物细胞中,这个糖苷键由FUT8基因编码的α-1,6-岩藻糖基转移酶催化形成。敲除FUT8基因将完全消除抗体Fc端的岩藻糖,从而提高单抗药物的ADCC作用。

传统的基于同源重组的基因编辑技术是一个高投入、低产出并且费时费力的过程,往往需要从106-109个细胞中才能筛选出一个被正确敲除的细胞。后续出现的一些可编码人工核酸酶基因编辑技术(如锌指酶、TALEN),它们依靠其DNA结合结构域结合到基因组中特定的位点上,然后,再依靠融合表达的酶切结构域,将该位点的DNA链切断。这样的人工核酸酶技术往往有着可识别序列受限制,编码过程复杂耗时以及作用效率低等缺点。
CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats即成簇出现规律间隔的短回文序列的缩写,此序列和CRISPR相关基因(Cas基因)共同作用,因其特有的RNA介导的核酸内切酶活性引起了生物学界的广泛关注,其中以来源于Streptococcus Pyogenes为代表的II类CRISPR/Cas9系统应用最为广泛,以RNA作为基因组定位工具,用特定序列的sgRNA(small-guide RNA)引导Cas9核酸内切酶识别并切割靶向序列。众所周知在体内合成RNA要比在体内合成蛋白质容易的多,而与人工开发的特异性DNA位点结合蛋白相比,RNA无论是在定位的准确性上还是在效率上都要好的多。基于RNA定位的CRISPR技术可以避开DNA甲基化对定位的影响,所以CRISPR/Cas9系统在基因组定位的自由度方面要 比人工开发的特异性DNA位点结合蛋白技术要大得多。编码一段RNA要比编码一段蛋白质容易,所以CRISPR/Cas9系统只需要很短的时间就可以得到实验结果。
FUT8大多数由哺乳动物细胞产生的单克隆抗体都是岩藻糖基化的,这其中当然也包括了最广泛使用的中国仓鼠卵巢细胞,岩藻糖与抗体Fc端上的氨基葡萄糖通过一个α-1,6糖苷键结合。在哺乳动物细胞中,这个糖苷键由FUT8基因编码的α-1,6-岩藻糖基转移酶催化形成。敲除FUT8基因将完全消除抗体Fc端的岩藻糖,从而提高单抗药物的ADCC作用。

传统的基于同源重组的基因编辑技术是一个高投入、低产出并且费时费力的过程,往往需要从106-109个细胞中才能筛选出一个被正确敲除的细胞。后续出现的一些可编码人工核酸酶基因编辑技术(如锌指酶、TALEN),它们依靠其DNA结合结构域结合到基因组中特定的位点上,然后,再依靠融合表达的酶切结构域,将该位点的DNA链切断。这样的人工核酸酶技术往往有着可识别序列受限制,编码过程复杂耗时以及作用效率低等缺点。
CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats即成簇出现规律间隔的短回文序列的缩写,此序列和CRISPR相关基因(Cas基因)共同作用,因其特有的RNA介导的核酸内切酶活性引起了生物学界的广泛关注,其中以来源于Streptococcus Pyogenes为代表的II类CRISPR/Cas9系统应用最为广泛,以RNA作为基因组定位工具,用特定序列的sgRNA(small-guide RNA)引导Cas9核酸内切酶识别并切割靶向序列。众所周知在体内合成RNA要比在体内合成蛋白质容易的多,而与人工开发的特异性DNA位点结合蛋白相比,RNA无论是在定位的准确性上还是在效率上都要好的多。基于RNA定位的CRISPR技术可以避开DNA甲基化对定位的影响,所以CRISPR/Cas9系统在基因组定位的自由度方面要 比人工开发的特异性DNA位点结合蛋白技术要大得多。编码一段RNA要比编码一段蛋白质容易,所以CRISPR/Cas9系统只需要很短的时间就可以得到实验结果。
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