在细胞培养时如何应对支原体污染
时间:2021-12-07 19:44:06 阅读:164
(1)细胞外形可以没有明显的变化,支原体可以与细胞共存,污染后细胞液不会死亡,细胞培养基过滤一般不发生浑浊;
(2)使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果,因为支原体会抑制细胞生长;导致染色体畸变;细胞膜抗原性改变;细胞复苏后存活率降低等。
(3)影响细胞的代谢和功能:培液中的精氨酸被支原体大量消耗,引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍;支原体活动使培液成分发生改变(如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质),影响细胞代谢。
(4)培养过程中细胞破碎较多,培养基pH变化明显,需要频繁更换新鲜培养基;
(5)细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。
四.支原体的检测方法
支原体的污染需要特殊的检查方法,常用的有 DNA 荧光染色法、支原体培养、ELISA、电镜和聚合酶链式反应(PCR)等,由于支原体种类众多,检测有失败的风险,通常推荐采用两种以上的检测方法。
2015版中国药典规定:“主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时,应同时进行培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检査支原体,必要时,亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。”
(1)DNA染色法:用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合,可使支原体内的DNA着色,荧光显微镜下支原体呈绿色小点,散在于细胞周围或附于细胞表面。Vero细胞DAPI染色荧光照片(400×)。A,感染支原体的Vero细胞。蓝色卵圆形荧光物质为Vero细胞核,其周围蓝色荧光小点为支原体(箭头);B,未感染支原体的阴性对照Vero细胞;C,加入待检培养液的Vero细胞(未感染支原体)。
(2)使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果,因为支原体会抑制细胞生长;导致染色体畸变;细胞膜抗原性改变;细胞复苏后存活率降低等。
(3)影响细胞的代谢和功能:培液中的精氨酸被支原体大量消耗,引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍;支原体活动使培液成分发生改变(如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质),影响细胞代谢。
(4)培养过程中细胞破碎较多,培养基pH变化明显,需要频繁更换新鲜培养基;
(5)细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。
四.支原体的检测方法
支原体的污染需要特殊的检查方法,常用的有 DNA 荧光染色法、支原体培养、ELISA、电镜和聚合酶链式反应(PCR)等,由于支原体种类众多,检测有失败的风险,通常推荐采用两种以上的检测方法。
2015版中国药典规定:“主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时,应同时进行培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检査支原体,必要时,亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。”
(1)DNA染色法:用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合,可使支原体内的DNA着色,荧光显微镜下支原体呈绿色小点,散在于细胞周围或附于细胞表面。Vero细胞DAPI染色荧光照片(400×)。A,感染支原体的Vero细胞。蓝色卵圆形荧光物质为Vero细胞核,其周围蓝色荧光小点为支原体(箭头);B,未感染支原体的阴性对照Vero细胞;C,加入待检培养液的Vero细胞(未感染支原体)。
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